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2、或护肤品 (57)摘要 本发明公开了一种包含STP和生长因子的活 性组合物及化妆品或护肤品。 所述STP和生长因 子的质量比为0.55： 1。 本发明的包含STP和生 长因子的蛋白复配活性组合物在透皮转运中透 皮的速率和渗透量理想， 适用于透皮转运系统和 化妆品领域。 权利要求书2页 说明书7页 附图5页 CN 106619170 A 2017.05.10 CN 106619170 A 1.一种包含STP和生长因子的活性组合物， 其特征在于， 所述STP和生长因子的质量比 为0.55:1。 2.根据权利要求1所述的活性组合物， 其特征在于， 所述STP选自棕榈酰五肽-3、 棕榈酰 三肽-1、
3、棕榈酰三肽-5、 棕榈酰六肽-9以及肉豆蔻酰五肽-11中的一种或多种； 所述生长因子为成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factors， FGFs)， 更优选碱 性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)； 所述STP和生长因子的质量比更优选为1:1。 3.一种预冻干制剂， 其特征在于， 所述预冻干制剂包括冻干保护剂以及如权利要求1所 述的包含STP和生长因子的活性组合物， 所述预冻干制剂的pH为67。 4.根据权利要求3所述的预冻干制剂， 其特征在于， 其中， 所述冻干保护剂为组氨酸和 海藻糖的组合， 或者为叔丁醇。
4、5.根据权利要求3所述的预冻干制剂， 其特征在于， 在所述预冻干制剂中， 所述STP的浓 度为0.001-0.1mg/ml， 所述组氨酸的浓度为5-150mM， 所述海藻糖的浓度为20-160mM， 所述 预冻干制剂的pH为6.8。 6.根据权利要求3所述的预冻干制剂， 其特征在于， 在所述预冻干制剂中， 所述STP的浓 度为0.001-0.1mg/ml， 所述叔丁醇的浓度为150-1000mM， 所述预冻干制剂的pH为6.8。 7.一种冻干制剂， 其特征在于， 其由如权利要求36任一项所述的预冻干制剂经冻干 工艺制备得到。 8.一种复原制剂， 其特征在于， 其由如权利要求7所述的冻干制剂与水
5、溶液混合得到， 所述水溶液为水、 生理盐水或磷酸盐缓冲液， 所述复原制剂的pH为68。 9.根据权利要求8所述的复原制剂， 其特征在于， 所述复原制剂的体积为所述冻干制剂 的体积的36倍。 10.一种化妆品或护肤品， 其特征在于， 所述化妆品或护肤品包括如权利要求1或2所述 的包含STP和生长因子的活性组合物。 11.根据权利要求10所述的化妆品或护肤品， 其特征在于， 所述化妆品或护肤品的制剂 类型为水剂、 霜剂、 乳剂、 凝胶剂或成膜剂。 12.根据权利要求10所述的化妆品或护肤品， 其特征在于， 所述化妆品或护肤品中， 所 述包含STP和生长因子的活性组合物含量为110wt。 13.根据
6、权利要求1012任一项所述的化妆品或护肤品， 其特征在于， 所述化妆品或护 肤品还包括醇类、 油剂、 pH调节剂和抗氧化剂中的一种或多种。 14.根据权利要求13所述的化妆品或护肤品， 其特征在于， 所述醇类选自乙醇、 丙三醇 和1,3-丁二醇中的一种或多种； 所述油剂选自脂肪酸、 高级醇、 液体石蜡和硅油中的一种或多种； 所述pH调节剂为柠檬酸-柠檬酸钠或乳酸-乳酸钠； 所述抗氧化剂选自烟酰胺、 核黄素和烟酸中的一种或多种。 15.根据权利要求1012任一项所述的化妆品或护肤品， 其特征在于， 所述化妆品或护 肤品还包括可用于化妆品或护肤品的复配成分， 所述复配成分选自左旋维他命C、 甲壳素
7、及 其衍生物、 壳聚糖、 虾青素、 水蛭肽、 双香豆素、 醋硝香豆素、 三七黄酮、 三七皂苷和芦荟提取 物中的一种或多种。 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106619170 A 2 16.根据权利要求15所述的化妆品或护肤品， 其特征在于， 所述复配成分占所述化妆品 或护肤品总质量的0.120， 更优选0.110。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106619170 A 3 包含STP和生长因子的活性组合物及其化妆品或护肤品 技术领域 0001 本发明属于化妆品领域， 具体涉及一种包含STP和生长因子的活性组合物及其化 妆品或护肤品。 背景技术 0002 透皮传递系统(t
8、ransdermal delivery system， TDS)， 是指在皮肤表面给予活性 成分， 活性成分以一定速率透过皮肤各层， 由毛细血管吸收进入人体循环而发挥其生物学 活性和生理功能。 。 然而皮肤的角质层作为生物屏障之一， 很多药物特别是亲水性药物难以 渗透进入皮肤或是渗透量难以达到治疗水平， 因而通过适当的方法促进药物的经皮渗透成 为研究TDS的关键。 在美容护肤领域， 活性物的理化性质各种各样， ， 不少活性成分在细胞水 平的筛选中效果显著， 但是由于皮肤屏障的存在， 很难突破皮肤角质层的限制进入到皮肤 深层甚至皮肤内发挥其生物学活性， 采用合适的促渗技术是美容护肤品发挥作用的关
9、键所 在。 。 0003 近年来， 医药界在透皮传递系统的研究方面突飞猛进， 从物理辅助导入、 化学吸收 促进剂的添加到微乳、 脂质体等各类新剂型的研发等都给化妆品的研发提供了宝贵的参 考。 但是， 对于生物活性蛋白这一类对皮肤具有显著功效的活性成分因为其相对分子质量 较大、 稳定性较低而促渗难度很大， 成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factors， FGFs)就是其中的一类。 成纤维细胞生长因子是由FGF基因家族编码的结构相关的一组蛋白 质多肽， 目前已知该家族至少包括23个成员。 碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor
10、,bFGF)是FGFs家族中的一员， 最初是由牛脑垂体和脑组织提取物中分离得 到的一个肝素结合多肽， 因为能促进成纤维细胞的分裂增殖而得名。 bFGF广泛分布于中胚 层和神经外胚层来源的多种组织和器官， 具有促进细胞增殖、 分化、 迁移等多种生物学效 应， 并参与血管重塑、 骨骼形成、 神经发育、 肿瘤代谢等生理和病理过程， 对皮肤而言能刺激 皮肤成纤维细胞、 皮肤干细胞和其他多种皮肤细胞的增殖分化， 已在美容护肤领域得到广 泛应用。 但由于分子量的限制bFGF的透皮吸收很困难， 因而在化妆品或护肤品中的应用受 到较大限制。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种包含STP和生长因子的活性
11、组合物及其化妆品或护肤 品， 实现由STP介导的生长因子的透皮传递， 以解决前述现有技术中存在的至少一项技术问 题。 0005 本发明的第一方面提供一种包含STP和生长因子的活性组合物， 其中， 所述STP和 生长因子的质量比为0.55:1。 0006 其中， 所述的STP是指信号转移肽(Signal transfer peptide)， 其含义为本领域 常规， 各类本领域常规的STP均适用于本发明， 其中， 更优选棕榈酰五肽-3、 棕榈酰三肽-1、 棕榈酰三肽-5、 棕榈酰六肽-9以及肉豆蔻酰五肽-11中的一种或多种。 说 明 书 1/7 页 4 CN 106619170 A 4 0007
12、所述生长因子为本领域常规的含义， 优选成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factors， FGFs)， 更优选碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)。 0008 其中， bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽， 分子量为1618.5KD， bFGF分子结构中有4个半胱氨酸， 以此形成分子的三维空间结构。 0009 所述STP和生长因子的质量比更优选为1:1。 0010 本发明的活性组合物可以应用于各种类型的化妆品或护肤品中， 具体应用形式不 限， 且效果突出。 0011 本发明的第二方面提供一种预冻干制
13、剂， 所述预冻干制剂包括冻干保护剂以及前 述包含STP和生长因子的活性组合物， 所述预冻干制剂的pH为67。 0012 其中， 所述冻干保护剂优选组氨酸和海藻糖的组合， 或者叔丁醇。 0013 优选地， 在所述预冻干制剂中， 所述STP的浓度为0.001-0.1mg/ml， 所述组氨酸的 浓度为5-150mM， 所述海藻糖的浓度为20-160mM， 所述预冻干制剂的pH为6.8。 0014 优选地， 在所述预冻干制剂中， 所述STP的浓度为0.001-0.1mg/ml， 所述叔丁醇的 浓度为150-1000mM， 所述预冻干制剂的pH为6.8。 0015 本发明的第三方面提供一种冻干制剂， 其
14、由前述预冻干制剂经冻干工艺制备得 到。 0016 所述冻干工艺没有特殊要求， 本领域常规的冻干工艺均适用于本发明， 如冷冻干 燥工艺等。 0017 本发明的第四方面提供一种复原制剂， 其由前述冻干制剂与水溶液混合得到， 所 述水溶液为水、 生理盐水或磷酸盐缓冲液， 所述复原制剂的pH为68。 0018 所述复原制剂中， 所述冻干制剂与水溶液的体积比没有特别限定， 以最终得到的 复原制剂的体积为所述冻干制剂的体积的36倍为佳。 0019 消费者可以直接使用所述复原制剂， 也可以将所述复原制剂在生理盐水中进一步 稀释后使用。 0020 本发明的第五方面提供一种化妆品或护肤品， 所述化妆品或护肤品包
15、括前述包含 STP和生长因子的活性组合物。 0021 优选地， 所述化妆品或护肤品的制剂类型为水剂、 霜剂、 乳剂、 凝胶剂或成膜剂。 0022 优选地， 所述化妆品或护肤品中， 所述包含STP和生长因子的活性组合物的含量为 110wt。 0023 优选地， 所述化妆品或护肤品还包括醇类、 油剂、 pH调节剂和抗氧化剂中的一种或 多种。 0024 优选地， 所述醇类选自乙醇、 丙三醇和1,3-丁二醇中的一种或多种。 0025 优选地， 所述油剂选自脂肪酸、 高级醇、 液体石蜡和硅油中的一种或多种。 0026 优选地， 所述pH调节剂为柠檬酸-柠檬酸钠或乳酸-乳酸钠。 0027 优选地， 所述抗
16、氧化剂选自烟酰胺、 核黄素和烟酸中的一种或多种。 0028 优选地， 所述化妆品或护肤品还包括可用于化妆品或护肤品的复配成分， 所述复 配成分选自左旋维他命C、 甲壳素及其衍生物、 壳聚糖、 虾青素、 水蛭肽、 双香豆素、 醋硝香豆 素、 三七黄酮、 三七皂苷和芦荟提取物中的一种或多种。 说 明 书 2/7 页 5 CN 106619170 A 5 0029 优选地， 所述复配成分占所述化妆品或护肤品总质量的0.120， 更优选 0.110。 0030 本发明取得了下述有益效果： 经实验证明， 本发明的包含STP和生长因子的蛋白复 配活性组合物在透皮转运中透皮的速率和渗透量理想， 适用于化妆品
17、领域。 附图说明 0031 图1显示实施例6中STP/bFGF和bFGF细胞增殖实验的结果。 0032 图2显示实施例6中STP/bFGF在细胞穿膜实验的结果， 分别为STP/bFGF-BFGFP在0, 10,20,30,60,120,240,480min时在细胞内的分布情况， 结果表明STP可促进细胞对bFGF的 吸收。 0033图3显示实施例8中功效评价结果之主观半定量评价(n15，)， 其中， 每一项 指标左边柱表示使用前， 右边柱结果表示使用60天后。 0034图4显示实施例8中功效评价结果之皮肤含水量(U， n15，)， 其中， 各曲线自 上至下依次为右脸颊、 左脸颊、 皮肤含水总量
18、、 左嘴角和右嘴角的数据。 0035图5显示实施例8中功效评价结果之皮肤弹性变化(n15，)， 其中， 左边使用 前的曲线起始点自上至下依次为左脸颊、 右脸颊、 总计、 右眼角和左眼角。 0036图6显示实施例8中功效评价结果之皱纹特征计数变化(n15，)。 0037图7显示实施例8中功效评价结果之纹理特征计数变化(n15，)。 0038图8显示实施例8中功效评价结果之毛孔特征计数变化(n15，)。 0039 图9显示实施例8中功效评价结果之产品使用前后对比， A： 1号受试者使用前面部 状况； B： 1号受试者使用后面部状况； C： 2号受试者使用前面部状况； D： 2号受试者使用后面 部状
19、况。 具体实施方式 0040 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚明白， 以下结合具体实施例， 并参照 附图， 对本发明作进一步的详细说明。 0041 本领域技术人员应当理解， 如无特别说明， 下述实施例中所用的试剂均为市售分 析纯级别的试剂。 0042 其中， STP购自南京莱昂生物科技有限公司， bFGF为暨南大学医药生物技术研究开 发中心自制。 0043 本申请的发明人在研究中发现， STP(Signal transfer peptide， 信号转移肽)能 促进大分子活性蛋白物质的吸收和传递， 将STP与bFGF的蛋白混合后进行的透皮转运实验 表明， 该蛋白组合物在透皮转运中透皮的
20、速率和渗透量理想， 且组合物自身能进行基质蛋 白， 尤其是胶原蛋白的合成， 同时还能增加弹性蛋白、 透明质酸、 糖胺聚糖和纤维连接蛋白 的生成， 起到祛皱抗衰的效果， 适用于化妆品领域。 0044 以下通过具体实施例详述本发明。 0045 实施例1STP/bFGF冻干制剂的制备 0046 取海藻糖3g， 组氨酸1g， 加入约50ml磷酸盐缓冲液(pH约6.8)， 再加入0.5mg的棕榈 说 明 书 3/7 页 6 CN 106619170 A 6 酰五肽-3和bFGF(浓度为2.3mg/ml)217 l， 加磷酸盐缓冲液(pH约6.8)至100ml， 即得预冻干 制剂。 0047 将预冻干制剂
21、经0.22 m微孔滤膜过滤除菌后， 分装到3ml的西林瓶中， 每瓶1ml， 根 据现有技术通过通常已知的冷冻干燥方法来实施冷冻干燥， 即得到STP/bFGF冻干制剂。 其 中， 使用的冷冻干燥方法可以参考下列著作中记载的方法： 第七章， 制剂冻干工艺解析(参 见： 张福成， 吴燕， 徐荣等， 药品食品冷冻干燥手册M， 军事医学科学出版社， 2011年)。 0048 实施例2STP/bFGF冻干制剂的制备 0049 取叔丁醇5g， 加入约50ml磷酸盐缓冲液(pH约6.8)， 再加入0.2mg的肉豆蔻酰五肽- 11和bFGF(浓度2.3mg/ml)87 l， 加磷酸盐缓冲液(pH约6.8)至10
22、0ml， 即得预冻干制剂。 0050 将预冻干制剂经0.22 m微孔滤膜过滤除菌后， 分装到3ml的西林瓶中， 每瓶1ml， 根 据现有技术通过通常已知的冷冻干燥方法来实施冷冻干燥。 其中， 使用的冷冻干燥方法同 实施例1。 0051 实施例3STP/bFGF复原制剂的制备 0052 将实施例1得到的冻干制剂与水混合， 调节pH至68， 即得复原制剂， 复原制剂的 体积为所述冻干制剂的体积的5倍。 该复原制剂即可供消费者直接施用， 同时消费者也可以 将所述复原制剂在生理盐水中进一步稀释后施用。 0053 实施例4STP/bFGF喷雾剂的制备 0054 取水溶性壳聚糖0.1g溶于1mL的冰醋酸中
23、， 加入约50ml双蒸水， 调pH到6， 再加入 0.1g EDTA-2Na， 0.2g PEG400， 溶解后再加入尼泊金甲酯和尼泊金乙酯各0.01g(先以适量 水加热溶解)， 搅拌均匀后高压灭菌(0.1Mpa、 121下灭菌15分钟)， 冷却至室温。 取实施例1 中得到的STP/bFGF的预冻干制剂， 经0.22 m微孔滤膜过滤除菌后加入上述混合液中， 调pH 至6.8， 加灭菌的双蒸水至100ml， 分装于喷雾剂瓶中， 即得。 0055 实施例5STP/bFGF凝胶剂的制备 0056 取卡波姆2g， 丙二醇4g， 对羟基苯甲酸甲酯0.5g， 右旋糖苷2g， 上述原料混合后呈 酸性， 为了
24、保证蛋白不变性， 加入三乙醇胺1g， 调pH值至6.8， 加水溶解至100mL， 混合均匀， 然后在0.1Mpa、 121条件下高压灭菌15分钟， 冷却至室温， 制成基质部分， 在基质中加入实 施例2中得到的STP/bFGF预冻干制剂， 同时缓慢搅拌均匀， 制成脂质体凝胶剂， 用于透皮转 运实验。 0057 实施例6STP/bFGF活性组合物对Balb/c 3T3细胞的促增殖作用 0058 将培养至对数生长期的Balb/c 3T3细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细 胞资源中心)用0.25的胰蛋白酶溶液消化， 之后重悬细胞并转接到96孔板中(5000个/ 孔)， 用含10胎牛血清的RPMI
25、 1640培养基培养。 培养24h后， 弃培养液， 换入含0.4胎牛 血清的DMEM培养液继续培养24h。 更换新鲜的含0.4胎牛血清的RPMI 1640培养液， 然后加 入不同终浓度的STP/bFGF、 bFGF和STP蛋白溶液， 37培养24h。 培养结束后， 加入10 L MTT 溶液(10mg/mL)， 摇匀， 继续培养4h后， 弃上清加入100 L二甲基亚砜(DMSO)， 37放置 30min， 震荡使结晶物充分溶解， 用酶标仪(570nm波长)测定吸光度值。 每个浓度设3个复孔， 重复3次， 同时以培养液作为空白对照。 结果请参见图1， 其中， 横坐标显示蛋白溶液的浓度 值(单位为
27、5BSA的PBS封闭1h。 加入单克隆一抗4孵育过 夜， PBS洗涤8次， 每次5min； 二抗室温孵育30min后， PBS洗涤8次， 每次5min； DAPI细胞核染色 7min， PBS洗涤8次， 每次5min。 最后进行激光共聚焦显微镜观察， 结果请参见图2。 图2的结果 表明， bFGF蛋白组给药后30min开始可在PC-12胞浆见绿色荧光， 且在1h后达到峰值； STP/ bFGF组经过10min即可在PC-12胞内见到绿色荧光且在30min后达到峰值且绿色荧光分布较 bFGF组多； 此结果说明STP可以促进细胞对bFGF的吸收。 0061 实施例8STP系列护肤品的功效评价 00
28、62 受试者人数15人， 年龄为3060岁的女性或男性， III或IV型皮肤， 具有皱纹、 皮肤 松弛或皮肤干燥等皮肤衰老现象。 无严重系统性疾病以及非过敏性体质。 受试部位近三个 月没有参与皮肤治疗， 美容或是其它皮肤测试。 测试产品为实施例5中制得的STP/bFGF凝胶 剂。 0063 评估周期为60天， 受试者共需到访7次。 分别是受试者筛选及基础值测定、 使用产 品后第10天、 20天、 30天、 40天、 50天和60天。 测试包括采用visia面部皮肤分析仪对受试者 进行面部图像分析和采用德国CK皮肤测试仪进行皮肤测试。 检测指标见表1， 指标检测结果 见表25和图39。 0064
32、与60d具有统计学意义(P0.05)。 左脸颊皮肤含水量在30、 40、 50、 60d与使用前比较具有统 计学意义(P0.05)， 40d、 60d具有显著差异(P0.01)。 左、 右嘴角皮肤含水量在40d与使用前 比较具有统计学意义(P0.05)。 皮肤总含水量在40d、 60d具有统计学意义(P0.05)。 结果表 明使用产品前后皮肤能有效提高其水分含量， 本发明的产品具有显著的保湿功能， 在30d时 开始改善显著， 40d为最高值， 之后有些许回落。 0078 (3)皮肤弹性变化 0079 R2值， 即无负压时皮肤的回弹量与有负压时的最大拉伸量之比。 R2值变化反映在 测试周期内，
37、使用前相比有显著差异性(p0.01)， 60d时有统计 学意义(p0.05)。 毛孔特征计数在30d、 50d及60d时与使用前相比有统计学意义(p0.05)。 结果表明使用产品后具有减少皱纹、 细致纹理和缩小毛孔的功能， 从30d时开始改善明显。 0090 需要说明的是， 上述实施例只是列举了本发明的部分可实现方式， 但实际上， 本发 明的STP/bFGF活性组合物可以用于制备各种常规形式的化妆品或护肤品， 如制备成水剂、 霜剂或乳剂等。 所述STP/bFGF活性组合物在各类产品中的比重也不仅限于前述实施例， 同 时， STP和bFGF的质量比也不限于前述实施例， 在0.55:1的范围内均有
38、较好的效果。 所述 的STP也不局限于前述实施例所述， 对于棕榈酰三肽-1、 棕榈酰三肽-5和棕榈酰六肽-9等均 有较好相当的效果。 申请人对各种形式的产品均进行了测试实验， 结果与前述列举的实施 例类似， 表明STP和bFGF具有很好的协同作用。 另外， 对于其他的一些与bFGF性质相似的生 长因子， STP同样能够介导其在透皮转运系统中有很好的转运和渗透， 受制于篇幅， 此处不 再不一一细举。 0091 以上所述的具体实施例， 对本发明的目的、 技术方案和有益效果进行了进一步详 细说明， 应理解的是， 以上所述仅为本发明的具体实施例而已， 并不用于限制本发明， 凡在 本发明的精神和原则之内， 所做的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护 范围之内。 说 明 书 7/7 页 10 CN 106619170 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/5 页 11 CN 106619170 A 11 图3 图4 说 明 书 附 图 2/5 页 12 CN 106619170 A 12 图5 图6 图7 说 明 书 附 图 3/5 页 13 CN 106619170 A 13 图8 说 明 书 附 图 4/5 页 14 CN 106619170 A 14 图9 说 明 书 附 图 5/5 页 15 CN 106619170 A 15
